摘 要：轉錄組比較發(fā)現(xiàn)，果肉黃色的‘金艷’獼猴桃成熟果實中優(yōu)勢表達基因的主要功能涉及代謝，而果肉含花青苷呈紅色的‘紅陽’中的優(yōu)勢表達基因一般與發(fā)育相關。獼猴桃果皮和外層果肉部分及內層果肉和果心部分的優(yōu)勢表達基因分別與光合作用和營養(yǎng)儲備有關。獼猴桃有相對較多的 R2R3 類型的 MYB 基因，幾乎所有類型的 MYB 基因都在果實中表達。MYB-A72 位于花青苷合成相關 MYB 基因分支，其轉錄本只在‘紅陽’中發(fā)現(xiàn)，在內層果肉和果心部分的表達水平很高。表達模式聚類分析表明：bHLH-B36 和 WD40-A126 可能參與形成 MYB-bHLH-WD40 調控復合體，而 CHI2、FLS1 和 CYP98A1 可能是受其調控的靶基因。
▲紅心獼猴桃果園
關鍵詞：獼猴桃；花青苷；MYB；基因家族；轉錄組分析
花青苷（anthocyanin）是一種重要的次生代謝產(chǎn)物，會根據(jù) pH 的變化而呈現(xiàn)紅色、紫色或者藍色，并且廣泛存在于植物的果實、種子、根和葉中?；ㄇ嘬諡辄S酮中多酚復合物的一個亞類，是糖基化的聚羥基或者聚甲氧基分子，由兩個芳香環(huán)通過 C3 橋連接一個苯環(huán)而成?；ㄇ嘬找驗榻Y構環(huán)上的取代基不同而被分為 702 種，此外有 27 種糖苷配基化的花青苷即花色素（Krga & Milenkovic，2019；Fu et al.，2020；Meng et al.，2020）。花青苷可溶于水，主要儲存于液泡，無明顯氣味，但可使食物略微苦辛?；ㄇ嘬湛梢晕ハx和獸類從而有利于植物傳播花粉和種子，還可以通過抵消活性氧或者自由基以及吸收紫外線來使植物應對脅迫和延緩衰老。對于人類而言，食用富含花青苷的食物可以治療心血管紊亂、糖尿病、肥胖癥、癌癥以及保護神經(jīng)系統(tǒng)（路靜 等，2019）。增加花青苷含量還能延長農產(chǎn)品的貨架期。
▲Large electric kiwi pollination equipment
花青苷的生物合成在高等植物里是一個高度保守的代謝途徑（Holton & Cornish，1995）。查爾酮合酶（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）和黃烷酮–3–羥化酶（flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）是花青苷合成的早期基因，其產(chǎn)物是二氫黃酮醇二氫山奈酚，它可被 F3’H 或者 F3’5’H 進一步羥基化?；ㄇ嘬丈锖铣赏砥诨蛴卸潼S酮醇–4–還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）、花青苷合酶（anthocyanin synthase，ANS）以及谷胱甘肽轉移酶（glutathione S-transferase，GST），它們也是花青苷生物合成途徑的特有酶。以上這些基因的缺失或者它們的酶產(chǎn)物的細微變化可使植物無法產(chǎn)生花青苷（Johnson et al.，2001；Povero et al.，2011；畢思琦 等，2019），例如轉座子跳躍引起的 DFR 和 CHI 基因失活就可使得牽牛和康乃馨的花出現(xiàn)斑駁的色塊（Inagaki et al.，1994；Itoh et al.，2002）。
MYB 是一大類轉錄因子，其中的 R2R3 類能與 bHLH 和 WD40 轉錄因子形成 MYB-bHLH-WD40復合體，從而調節(jié)花青苷生物合成基因的表達（曹雨薇 等，2019；宋楊 等，2019）。例如，在番茄中表達金魚草的 bHLH 基因和 MYB 基因可獲得果皮和果肉均是紫色的果實，并且其花青苷含量可以媲美黑莓和越橘（藍莓）；這兩個基因不僅激活了花青苷合成晚期基因，也激活了其早期基因（Butelli et al.，2008）。反過來，雖然玉米的 MYB 基因與自身花青苷的合成有關，但在轉基因番茄中只能增加黃酮而不能改變花青苷的含量，這是因為番茄的 F3’5’H 沒有被它激活（Bovy et al.，2002）。一些不依賴MYB的WD40基因也可調控花青苷合成基因的轉錄（Mehrtens et al.，2005；Stracke et al.，2007；Gonzalez et al.，2008）。另外多個 MYB 基因之間相互配合會導致花青苷分布的復雜模式，例如使蝴蝶蘭的每朵花都可能有不同的顏色（Hsu et al.，2015）。
▲紅心獼猴桃圖片
MYB 基因的自然變異與花青苷的產(chǎn)生關系密切。例如普通番茄不含花青苷的 1 個重要原因是自然變異使其 MYB 基因 Aft 不能正常剪接（Sun et al.，2020），而胡蘿卜不能產(chǎn)生花青苷是因為其DcMYB7 的上游調控區(qū)被插入序列所破壞（Xu et al.，2019）。相反，蘋果 MdMYB10 的上游調控區(qū)的 23 堿基對正向重復強化了對自身的正調控并最終導致了紅色果肉（Espley et al.，2009）；發(fā)生在蝴蝶蘭中的逆轉座使得 PeMYB11 表達上調，從而促進了該植物中花青苷的積累以及黑色花的出現(xiàn)（Hsu et al.，2019）。轉座還使 1 個 R2R3 類型的 MYB 基因的表達上調，從而使得花椰菜變?yōu)樽仙–hiu et al.，2010）。逆轉座不僅激活了紅肉柑橘的 MYB 基因 Ruby，還為這個基因提供了低溫激活的順式調控元件（Butelli et al.，2012）。
獼猴桃果實由多心皮的上位子房發(fā)育而來，可分為果皮、果肉和果心 3 部分。中華獼猴桃品種‘紅陽’的內層果肉積累了花青苷呈紅色，這可能與 AcMYB10/75/F110、UDP–黃酮糖基轉移酶基因 AcUFGT3a 以及谷胱甘肽巰基轉移酶基因 AcGST1 有關（Li et al.，2015，2017b；Liu et al.，2017，2019），AcMYB75 和 AcMYB123 的表達受到干擾時花青苷的積累會減弱（Wang et al.，2019；Yu et al.，2019），AcMYB75 基因也可能在其他獼猴桃中調控花青苷的合成（Li et al.，2018，2019）。采后低溫貯藏中‘紅陽’果實的花青苷含量會增加，這時 AcMYBA1-1 和 AcMYB5-1 以及一些可能的花青苷合成基因的表達也升高（Montefiori et al.，2010；Li et al.，2017）。環(huán)境因素，如高溫可抑制‘紅陽’中花青苷的生成（Man et al.，2015）。不過，同類型的 MYB 基因也與獼猴桃果實中葉綠素和類胡蘿卜素的積累有關（Ampomah-Dwamena et al.，2019）。目前，MYB 基因是否決定了‘紅陽’內層果肉的花青苷合成仍不明確?！鹌G’果肉黃色，是毛花獼猴桃（母本）與中華獼猴桃（父本）的雜交種，與‘紅陽’遺傳背景相近。比較二者果實的轉錄組，以期為揭示‘紅陽’內層果肉紅色的分子機理提供線索。
1 材料與方法
1.1 材料及取樣
在收獲季節(jié)（2019 年 9 月）采摘‘紅陽’和‘金艷’獼猴桃（Actinidia chinensis）的果實，低溫運送到實驗室并及時取樣。一是整個果實切薄片（分別命名為‘紅陽’全果和‘金艷’全果），二是去掉果皮和外層果肉（包括外、中、內果皮部分）后將內層果肉（果實的胎座部）和果心切成薄片（分別命名為‘紅陽’內層果肉和果心以及‘金艷’內層果肉和果心）。每個樣本涉及多個不同的果實，并且包含 3 個生物學重復。將薄片樣品經(jīng)液氮速凍后于–70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 轉錄組測序
樣本送生工（上海）測序。用 CTAB 法提取樣品 RNA。利用片段化后的 mRNA 和隨機引物進行 cDNA 合成，然后在其兩端加上接頭并進行純化。每個樣品建立 1 個測序文庫，用 Illumina Hiseq X 進行測序，并通過邊合成邊測序的方法進行雙端測序。對所測讀序（read）進行過濾，然后組裝轉錄本，所用程序為 Trinity，主要參數(shù)為“min_kmer_cov 2”，最后將最長的轉錄本指定為元基因（unigene）。
1.3 差異表達分析
用 R 程序DESeq2 分析每個元基因所涉的所有讀序的數(shù)量（count），通過 padj < 0.05 和|log2FoldChange| > 1 篩選差異表達基因。通過比較‘紅陽’全果的 3 個樣本即HD1 ~ HD3 和內層果肉和果心的 3 個樣本（HX1 ~ HX3）得到‘紅陽’果實外圍及其內部果肉之間的差異表達基因，以及從‘金艷’全果的 3 個樣本（JD1 ~ JD3）和內層果肉和果心的 3 個樣本（JY1 ~ JY 3）得到‘金艷’果實外圍及其內部果肉之間的差異表達基因。通過 HD1 ~ HD3 和 JD1 ~ JD3 得到‘紅陽’和‘金艷’果實全果之間的差異表達基因，以及通過 HX1 ~ HX3 和 JD1 ~ JD3 得到這兩種獼猴桃內部果肉之間的差異表達基因?；虮磉_水平用每百萬個讀序中的轉錄本數(shù)（transcripts per million reads，TPM）來衡量，其熱圖用 R 程序 heatmap 生成。原始讀序以及它在每個元基因中的數(shù)量已登錄 NCBI，編號為 GSE157207。
1.4 功能富集分析
首先分別在數(shù)據(jù)庫 Swissprot 和 TrEMBL 中進行相似性序列搜索，然后從數(shù)據(jù)庫 Uniprot 得到各個序列的 GO 注釋，最終建立每個元基因的 GO 注釋。使用 R 程序 clusterProfiler 進行功能富集分析，并采用超幾何分布檢驗方法，用矯正后的P值（即Q值） < 0.05界定顯著差異的生物功能。用REVIGO（http：//revigo.irb.hr/）縮減 GO 條目，然后得到每兩個 GO 之間共同基因的比例的矩陣，最后用 R程序 hclust 以及歐式距離和平均數(shù)法進行聚類分析。
1.5 MYB 基因分析
利用擬南芥 MYB 基因通過 BLAST?的 tblastn 以及 1e-005 的 E 值搜索‘紅陽’基因組重疊群（contig）序列，用 Augustus進行基因預測，之后用 hmmer （McClure et al.，1996）鑒定基因組和轉錄組 MYB 基因，最后用 ClustalW（Thompson et al.，1994）進行序列比對，用 FastTree（Price et al.，2009）構建基因樹，以及用 iTOL生成樹圖。
2 結果與分析
2.1 總體差異表達基因分析
兩個品種 4 種取樣各 3 次重復，共 12 個樣本的測序數(shù)據(jù)表明，每個文庫有（45.5 ± 4.6）百萬條讀序，讀序的平均長度為（141 ± 2）bp（最大值為 150 bp），其中 Q30（準確率超過 99.9%）堿基占 95.0% ± 0.1%。在序列組裝方面，‘金艷’的轉錄本有 245 244 條，它們進一步組成了 128 044 個元基因；‘紅陽’有 222 866 個轉錄本和 113 220 個元基因?！鹌G’和‘紅陽’的數(shù)據(jù)總共對應了26 194 個基因，這占基因組預測基因數(shù)（即 39 040 個）的 78.1%。比較‘金艷’與‘紅陽’全果，‘金艷’有 1 259 個優(yōu)勢表達基因（preferentially expressed gene，PEG），‘紅陽’有 1 334 個 PEG。功能富集分析表明，‘金艷’全果的 PEG 涉及了 15 個生物過程、26 個細胞成分以及 17 個分子功能；‘紅陽’全果的 PEG 涉及了 11 個生物過程、10 個細胞成分以及1 個分子功能?！鹌G’全果的突出功能有 ATP 水解偶聯(lián)的跨膜轉運、細胞呼吸作用、裂解酶相關的有機氮化物復合物的合成、甲基轉移酶介導的含硫復合物的合成、碳水化合物代謝、細胞壁形成、液泡膜上的離子轉運、內質網(wǎng)膜上的催化反應、胞外空間的肽酶活性以及細胞骨架結構；‘紅陽’全果中活躍的功能包括細胞大分子代謝、光合作用、晝夜節(jié)律、蛋白修飾、多肽交聯(lián)以及光合作用碳固定。
比較‘金艷’與‘紅陽’內層果肉和果心發(fā)現(xiàn)，前者有 885 個 PEG 而后者有 2 210 個 PEG，但在與各自的全果 PEG 疊加后‘金艷’內層果肉和果心有 511 個 PEG，而‘紅陽’內層果肉和果心有792 個 PEG?！鹌G’內層果肉和果心的 PEG 涉及了 48 個 GO 條目，而‘紅陽’是 77 個?！鹌G’內層果肉和果心特有的 GO 條目涉及細胞壁上的碳—碳裂解和烴基轉移、液泡和質體跨膜轉運陽離子、酯鍵水解和多肽酶解、發(fā)生于質膜的病毒免疫反應、黃酮合成、胞內外的酸性磷酸酶活性等；‘紅陽’內層果肉和果心特有 GO 條目涉及光合作用、自噬反應、泛素途徑、大分子代謝、氮化合物代謝、轉錄調控、乙烯通路、RNA 剪接、光照應答、胚后發(fā)育以及晝夜節(jié)律?？傮w上，‘金艷’PEG 似乎主要圍繞著代謝，而‘紅陽’中與發(fā)育有關。
比較‘紅陽’全果與內層果肉和果心發(fā)現(xiàn)，果皮和外層果肉的 PEG 有 320 個，內層果肉和果心的 PEG 有 316 個。果皮和外層果肉 PEG 涉及了 12 個生物過程、6 個細胞組分和 8 個分子功能；而內層果肉和果心有 21 個生物過程、14 個細胞組分以及 13 個分子功能。‘紅陽’果皮和外層果肉 PEG涉及的功能有氧脂合成、光合作用、轉錄因子結合調控、茉莉酸應答以及碳固定，而與其內層果肉和果心 PEG 有關的功能包括氨同化、多肽交聯(lián)、亞精胺合成、嘌呤核苷合成、藥物代謝、溫度/過氧化氫/真菌等逆境應答、細胞壁生成、多糖代謝、細胞體積平衡以及水分/離子運輸。
‘金艷’果皮和外層果肉的 PEG 有 1 626 個，而內層果肉和果心的 PEG 有 326 個；與‘紅陽’的 PEG 疊加后發(fā)現(xiàn)，兩品種果皮和外層果肉 PEG 有 98 個，而內層果肉和果心的 PEG 有 66 個。兩品種果皮和外層果肉 PEG 涉及 1 個分子功能（GO:0016491，氧化還原活性）、2 個細胞組分（GO:0044434，葉綠體部分；GO:0009579，內囊體）以及 20 個生物過程，而生物過程條目主要圍繞葉綠體里脂氧化物的合成、細胞對活性氧的應答、光合作用及其調控以及對細菌的免疫反應。兩品種內層果肉和果心 PEG 涉及了 2 個細胞組分（GO:0005887，質膜整合組分；GO:0044459，質膜部分），而生物過程和分子功能主要在營養(yǎng)儲備、品質調控、碳水化合物的跨質膜運輸、細胞大小控制、失水應答等方面。
2.2 MYB 基因差異表達分析
分析轉錄組序列和基因組序列發(fā)現(xiàn)，‘紅陽’和‘金艷’共有 194 個 R2R3 類型的 MYB 基因，它們在系統(tǒng)發(fā)育樹上分別位于 A、B、C、D 和 F 等 5 個分支（圖 1）。A 分支最為龐大，可進一步分為一大一小兩個亞支；其中獼猴桃有 158 個成員，并含有藻類基因。A 分支的花青苷合成相關MYB 基因聚在一起，并且形成了 3 個主要的簇。B 分支里有 20 個獼猴桃基因，它們可形成 3 個同時包含了藻類基因的簇。C 分支只有 9 個獼猴桃基因且沒有藻類基因，而 D 分支包含了 5 個獼猴桃基因和一些藻類基因。F 分支沒有與其他 R2R3 基因聚在一起，但它也含有 2 個 MYB 結構域、并且在序列上與 D 分支非常相似。另外，3R 類型的 MYB 基因（含有 3 個串聯(lián)的 MYB 結構域）組成 E分支，里面有 7 個獼猴桃基因，并且同時存在人類基因。G 分支為 4R 類型，有 2 個獼猴桃基因，然而這里的人類和酵母基因只有兩個 MYB 結構域。
轉錄組數(shù)據(jù)表明，A 分支 39%（62 個）的 MYB 基因在果實里表達，其中 10 個為‘金艷’PEG，9 個為‘紅陽’PEG；B 分支里 60%（12 個）的 MYB 基因在果實里表達，并且 3 個 PEG 都來自‘紅陽’；C 分支各個基因均不在果實里表達；D 分支只有 1 個基因（20%）在果實里表達，并且為‘金艷’的 PEG；E 分支有 4 個基因（57%）在果實里表達，并且其中 3 個屬于‘金艷’；F 分支有 1 個（50%）、G 分支有 2 個（100%）基因在果實里表達，不過它們的表達水平在兩種獼猴桃之間都沒有顯著差異（圖 1）。
在花青苷合成相關的 MYB 基因中，MYB-A63 在‘紅陽’中的表達水平是‘金艷’中的 6.3 倍；MYB-A72 是 7.1 倍，MYB-A84 接近 6.0 倍。與 MYB-A63 親緣關系最近的 MYB-A74 不在果實中表達，而離 MYB-A72 最近的 MYB-A73 以及離 MYB-A84 最近的 MYB-A83 的表達水平在兩種獼猴桃之間沒有顯著差異。MYB-A72 在‘紅陽’中生成了轉錄本，而在‘金艷’中未發(fā)現(xiàn)；‘金艷’中與之最相似的是 MYB-A73。MYB-A63 和 MYB-A84 的轉錄本在‘金艷’和‘紅陽’中均有發(fā)現(xiàn)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，MYB-A63、MYB-A72 和 MYB-A83 像所有 R2R3 類型的 MYB 基因一樣，在 R3 結構域中擁有結合 bHLH 蛋白的位點（圖 2）。MYB-A62 和 MYB-A75 還擁有花青苷合成相關 MYB 基因特有的基序，如前者中為 RPQPRIF（圖 2）
2.3 花青苷合成相關基因差異表達分析
轉錄組序列和基因組序列分析，從獼猴桃中鑒定了 196 個 bHLH 基因和 271 個 WD40 基因，而在果實中表達的分別有 69 和 155 個（圖 3），在‘金艷’中分別有 8 個和 13 個為 PEG，在‘紅陽’中分別有 23 個和 21 個為 PEG。獼猴桃有兩個 ANS 基因，其中 1 個在果實里表達。獼猴桃的所有 3個 F3H 都在果實里表達，并且 F3H1 在‘金艷’里為 PEG。獼猴桃一共有 4 個 FLS 基因，其中兩個在果實里表達。獼猴桃的 4 個 DFR 基因均在果實中轉錄，兩個品種間表達水平也沒有顯著差異。
獼猴桃有 4 個 CHS 基因和 3 個 CHI 基因，其中 CHS1 在‘金艷’里為 PEG。在 5 個 HCT 基因中，HCT1 和 HCT2 為‘金艷’的 PEG。獼猴桃有 7 個 CCoAOMT 基因，并且其中 3 個在果實里表達，CCoAOMT3 在‘金艷’中為 PEG。獼猴桃一共有 4 個 CYP98A 基因，其中 CYP98A4 在‘金艷’中為 PEG，而 CYP98A2 為‘紅陽’的 PEG。
轉錄本 TPM 值的聚類分析表明，C1 簇的大部分基因在‘金艷’里有更高的表達水平，有的表現(xiàn)在內層果肉和果心，有的表現(xiàn)在全果，有的二者中都有。高表達只出現(xiàn)于內層果肉和果心樣本的基因可能其表達范圍就局限在該部位，在全果中的含量就會被稀釋。類似地，高表達只出現(xiàn)于全果樣本的基因其主要表達部位可能是外層果肉。兩種樣本均高表達的基因則可能在整個果實中均勻表達。C1 簇含有 MYB、WD40 和 bHLH 基因的不同進化分支，并且所有表達的 DFR、CCoAOMT 和HCT 基因都在這個分支內，此外還有 CHS1、F3H1 和 CYP98A4。C2 簇在‘紅陽’中的表達水平比在‘金艷’中高，并且主要表現(xiàn)在全果樣本；C2 簇含有各類調控基因，如 MYB-A63 以及酶基因CHS2/3/4 和 CYP98A2。C3 簇也在‘紅陽’中高表達，但在一個全果樣本中表達水平相對較低。因此，與 C2 相比，C3 可能更多地在內層果肉和果心中表達。C3 含有 MYB-A72 以及 CHI2、FLS1/2和 CYP98A1。C4 簇在‘金艷’和‘紅陽’中都有表達，而且都在全果樣本中低表達，同時該簇包含少量的 MYB 基因以及酶基因 F3H2/3 和 ANS 基因。
▲獼猴桃結果像葡萄一樣多了
3 討論
‘金艷’和‘紅陽’全果各自的 PEG 數(shù)目相當，但前者涉及更多的 GO 條目，這暗示著更活躍的生理機能。‘金艷’是毛花獼猴桃（母本）與中華獼猴桃（父本）的雜交種，而‘紅陽’極有可能由中華獼猴桃的體細胞變異而來。研究表明‘金艷’有明顯的雜交優(yōu)勢（鐘彩虹 等，2015）。與此一致，遺傳因素極有可能使得美味獼猴桃和中華獼猴桃的果實具有不同的表皮下細胞結構和葉綠素脫除反應（Li et al.，2015；Gambi et al.，2018）。鮮果的生命活動涉及生物活性物質的積累、品質成分的改變、細胞壁變化、對病蟲害逐漸易感，這些有諸多的內部影響因素（如轉錄因子、植物激素、一氧化氮、光信號轉導、鈣、小的非編碼 RNA、表觀遺傳調控）和外部影響因素（如自然環(huán)境、栽培方法和采后貯藏）。總的來說，鮮果的成熟是一個極度異質的過程，比如即使果實的大小不再變化、其內在品質還會繼續(xù)改變（Ho，1996）。需要說明的是，在湖南吉首地區(qū) 9 月獼猴桃采收時，‘紅陽’已基本成熟，而‘金艷’尚未徹底成熟（尹翠波，2008），因此發(fā)育方面的因素可能使‘金艷’全果的 PEG 涉及更多的 GO 條目?！鹌G’內層果肉和果心的 PEG 及 GO 都少于‘紅陽’，經(jīng)過全果差異基因疊加過濾后，‘金艷’的 PEG 的數(shù)目仍只從相當于‘紅陽’的 40%上升到 60%?？梢姡t陽’內層果肉和果心的生命活動更加活躍?！t陽’果實一般較小，這有利于外界刺激，如光線深入內部，與此一致其內層果肉和果心 PEG 的 GO 涉及了光合作用和晝夜節(jié)律。另外，‘紅陽’特有的花青苷的合成發(fā)生在果實內部?！t陽’的外果和內層果肉及果心有著數(shù)量相當?shù)?PEG，但二者有著各自不同的 GO，特別是外果有標志性的光合作用，而內層果肉和果心與營養(yǎng)儲備有關。所以，獼猴桃果實的生命活動有著明顯的區(qū)隔化。最近的研究表明，番茄果實的成熟是一個從內向外逐步推進的過程（Shinozaki et al.，2018）。獼猴桃與番茄同屬漿果，并有較近的進化關系，因此它的成熟也可能有逐層推進的特點?！鹌G’果皮和外層果肉比內層果肉和果心的 PEG 顯著多，則可能是獼猴桃果實成熟逐層推進的體現(xiàn)。
▲獼猴桃包裝盒
獼猴桃的 R2R3 類型的 MYB 基因分別位于 5 個分支，并且?guī)缀趺總€分支都包含藻類基因。另外，A 分支和 B 分支還分別可以進一步分為 2 個和 3 個亞支，而它們同時也包含藻類基因。因此，在陸地植物與藻類植物的共同祖先里，可能有 8 個 R2R3 基因。E 分支和 G 分支含有更多的 MYB
結構域，并且能在真菌以及動物里找到同源基因。所以，這兩方面的證據(jù)表明 R2R3 類型的 MYB基因為植物所特有。4R 類型的 MYB 基因在植物和動物之間出現(xiàn)了分化，而 3R 類型的基因可能通過丟失第 1 個 MYB 結構域而產(chǎn)生了植物特有的 R2R3 類型（Dubos et al.，2010）。和較近的基因組相比（Huang et al.，2013；Gates et al.，2016），獼猴桃的 R2R3 基因顯著增加。與此一致，4R 類型的基因在獼猴桃里有 2 個，而其他報道的植物中只有 1 個（Dubos et al.，2010；Stracke et al.，2010）。
▲獼猴桃開花授粉
獼猴桃的約 54.3%的 MYB 基因在果實里表達，并且涉及了 C 分支以外的其他所有分支或者亞支，這暗示果實的發(fā)育和成熟需要多種類型的 MYB 基因。果實是被子植物獨有的結構，并且因為進化適應性形成了干果和肉果兩大類型（Ruiz-Sanchez & Sosa，2015），而肉果又分為躍變型和非躍變型。因此，C 分支可能在其他類型的果實里、甚至在獼猴桃果實發(fā)育和成熟的其他時期里特異性表達。
與此同時，多個 MYB 基因之間可能相互作用（Hsu et al.，2015；Colanero et al.，2020），從而形成功能微調并導致果實多樣。如前所述，各個分支內 MYB 基因在‘金艷’和‘紅陽’之間的差異表達，既可能有遺傳、又可能有發(fā)育上的原因。
▲獼猴桃苗
MYB-A72 在‘紅陽’中的表達水平顯著較高，并且它的蛋白產(chǎn)物具有典型的 R2R3 結構，以及具有結合 bHLH 蛋白的位點。該基因與已知的花青苷合成相關 MYB 基因處于相同的簇。更為重要的是，MYB-A72 只在‘紅陽’而不在‘金艷’的果實中存在。并且，MYB-A72 在‘紅陽’的內層果肉和果心有一定水平的表達。因此，MYB-A72 可能是‘紅陽’紅色果肉的遺傳因素。花青苷合成相關 MYB 基因往往只是上游的調控區(qū)發(fā)生了變異，從而在轉錄水平上被激活，并可能產(chǎn)生對特定環(huán)境因素如低溫的專一性應答，例如紅肉柑橘的 MYB 基因 Ruby （Butelli et al.，2012）。雖然 MYB-A75被認為與‘紅陽’內層果肉和果心花青苷的積累有關（Li et al.，2018，2019），但其在‘金艷’和‘紅陽’中表達水平?jīng)]有顯著差異。果實里除表達 MYB 基因外，還表達眾多的 WD40 和 bHLH 基因以及各種花青苷合成酶基因，這些基因可分成不同的表達簇，有的在‘金艷’和‘紅陽’間、或者內層果肉和果心以及果皮和外層果肉間差異表達。與 MYB-A72 同處一簇的 WD40-A126 以及bHLH-B36 在‘紅陽’中的表達水平顯著高于‘金艷’，并且在‘紅陽’中主要表達位置是內層果肉和果心。因此，MYB-A72、bHLH-B36 和 WD40-A126 有可能形成 MBW 調控復合體。MBW 復合體是植物進行轉錄調控的 1 個重要形式，參與包括花青苷合成在內的多項生命活動。MBW 的 3 種成分可能具有細胞自主性，所以只有它們同時出現(xiàn)于同 1 個細胞才能發(fā)揮作用，這往往使得花青苷只分布在狹窄的組織區(qū)域（Colanero et al.，2020）。CHI2、FLS1 和 CYP98A1 與以上 MBW 基因同處1 個表達簇，也在‘紅陽’內層果肉和果心中高表達。因此，它們可能是該調控途徑中的靶基因。
Abstract：Transcriptome comparison found that preferentially expressed genes（PEGs）were mainly involved in metabolism in the yellow-fleshed ripened‘Jinyan’kiwifruit，while they were generally related to development in red-fleshed‘Hongyang’. Meanwhile，PEGs from the peripheral part consisting of the peel and the outer layer of kiwifruits flesh and the remained core flesh part were related to their own hallmark function namely photosynthesis and nutrient reservoir，respectively. Kiwifruit possessed relatively abundant MYB genes of R2R3 type，and nearly all types of MYB genes were expressed in fruits.
MYB-A72 transcript could only be found in‘Hongyang’，and it possessed extremely high level of expression in the core flesh part，and additionally it was located within the clade including MYB genes for anthocyanin biosynthesis. Expression pattern clustering analysis revealed that bHLH-B36 and WD-A126 might participate in forming the MYB-bHLH-WD40 regulatory complex，and that CHI2，F(xiàn)LS1，and CYP98A might be the targets under its regulation.
Keywords：kiwifruit；anthocyanins；MYB；gene family；transcriptomic analysis
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