獼猴桃花粉活力測(cè)定條件的優(yōu)化研究a

獼猴桃花粉活力測(cè)定條件的優(yōu)化研究A
作者：徐達(dá)，王夢(mèng)欽，董云龍，張?jiān)品?云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 云南生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程中心)
摘要：人工輔助授粉是獼猴桃優(yōu)產(chǎn)高效栽培的重要保障之一，而花粉質(zhì)量是其中最為重要的限制因素。本研究以不同電商平臺(tái)銷(xiāo)售的獼猴桃花粉為材料，基于正交試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)TTC法測(cè)定獼猴桃花粉活力的條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)萌發(fā)率、授果率與花粉活力進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，不同電商銷(xiāo)售的花粉在花粉數(shù)量、花粉活力、萌發(fā)率及坐果率上均存在較大差異；TTC法檢驗(yàn)獼猴桃花粉活力的最佳條件為T(mén)TC濃度、染色溫度、染色時(shí)間分別為0.7%、30℃、25min；花粉萌發(fā)最佳條件為0.2%硼酸、15%蔗糖；在獼猴桃人工授粉過(guò)程中，花粉萌發(fā)率與坐果率的相關(guān)性最高，而花粉活力與萌發(fā)率并非完全一致；部分電商平臺(tái)銷(xiāo)售花粉的花粉活力低、坐果率低。因此，在互聯(lián)網(wǎng)背景下，涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)加強(qiáng)管理。
關(guān)鍵詞：獼猴桃，花粉量，花粉活力，離體萌發(fā)，響應(yīng)面分析

▲獼猴桃雌花、獼猴桃雄花

Study on the Condition Optimization for Pollen Vitality Test of Kiwifruit
Abstract: Artificial supplementary pollination is one of the important technical guarantees for efficient cultivation of kiwifruit, and the pollen quality is the top limiting factor for artificial pollination during the cultivation. Based on the orthogonal experiment and the response surface design, the condition optimization for pollen vitality test with TTC staining was studied with differential pollen samples of kiwifruit purchased from ecommerce platforms. Meanwhile, the correlations of pollen vitality with in vitro germination rate of pollen and fruit setting rate were analyzed. The results showed that the pollen amount, pollen vigor, germination rate and fruit setting rate had obvious differences among the pollen samples. The best condition for TTC staining test of kiwifruit pollen vitality was TTC concentration of 0.7%, dyeing temperature of 30℃, and dyeing time of 25 min. The optimum condition for pollen germination was boric acid of 0.2% and sucrose content of 15%. The results also showed that the pollen germination rate and fruit setting rate had high correlation during artificial pollination, but the pollen vitality and the germination rate was not well consistent. And some pollen samples bought from e-commerce platforms had low pollen vitality and low fruit setting rate. Therefore, the on-line business of agricultural production materials should be well managed and supervised.
Keywords: kiwifruit; pollen amount; pollen vitality; in vitro germination; response surface analysis

▲testing pollen

引言
獼猴桃也稱(chēng)奇異果，為獼猴桃科獼猴桃屬的植物果實(shí)。全世界共發(fā)現(xiàn)66個(gè)種、約118個(gè)分類(lèi)單元，其中中國(guó)有62個(gè)種，獼猴桃資源極為豐富。1904年新西蘭從中國(guó)引種獼猴桃，隨后選育出多個(gè)優(yōu)良品種(系)。經(jīng)100多年的發(fā)展，獼猴桃不僅成為目前全世界野生馴化最為成功的水果之一，也成為品種多樣程度高、世界流行水果之一?！吨袊?guó)獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展報(bào)告(2020)》的數(shù)據(jù)顯示，獼猴桃的栽培已廣布于世界5大洲23個(gè)國(guó)家和地區(qū)，截至2020年，全球獼猴桃種植面積達(dá)到28萬(wàn)hm，全球獼猴桃產(chǎn)量為451.8萬(wàn)t。中國(guó)獼猴桃種植面積達(dá)到19.3萬(wàn)hm，產(chǎn)量為229.1萬(wàn)t，無(wú)論種植面積還是產(chǎn)量都是穩(wěn)居世界第一。

▲獼猴桃公花采收

作為雌雄異株植物，獼猴桃的天然授粉坐果率極低，外加雌雄株花期不遇、天氣影響等原因致使僅依靠天然授粉很難獲得高質(zhì)優(yōu)效的栽培效果，人工輔助授粉成為獼猴桃優(yōu)產(chǎn)高效栽培中極為重要技術(shù)手段。山區(qū)栽培獼猴桃，由于栽培面積小、栽培分散，獼猴桃栽培果農(nóng)的花粉或購(gòu)于電商平臺(tái)，或由技術(shù)合作單位供給。而花粉在采集、保存中受多種因素的影響，其活力、萌發(fā)率、授精率都不穩(wěn)定，給果農(nóng)的生產(chǎn)帶來(lái)極大風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)獼猴桃花粉的研究主要集中花粉對(duì)果實(shí)品質(zhì)影響、活力測(cè)定及其影響因素、花粉培養(yǎng)、花粉散粉規(guī)律、花粉萌發(fā)與外界環(huán)境的關(guān)系叫等方面。在花粉質(zhì)量控制方面，尤其是對(duì)電商平臺(tái)所售花粉的質(zhì)量評(píng)價(jià)及采用何種指標(biāo)有效判定獼猴桃授精情況缺乏研究。本研究以不同電商平臺(tái)銷(xiāo)售的獼猴桃花粉為材料，基于正交試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)TTC法測(cè)定獼猴桃花粉活力的條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)花粉的萌發(fā)率、坐果率與花粉活力間的相關(guān)性做分析，以期為后續(xù)的研究和生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

▲獼猴桃花粉活力測(cè)定條件的優(yōu)化研究

1 材料與方法
1.1材料
試驗(yàn)材料為購(gòu)于電商平臺(tái)的獼猴桃花粉5份，其中2份由云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司所提供，另外3份由實(shí)驗(yàn)室選購(gòu)。電商平臺(tái)銷(xiāo)售的獼猴桃花粉價(jià)格不一、評(píng)價(jià)差異大、選購(gòu)次數(shù)不同，價(jià)格一般在10~30元/g，選購(gòu)次數(shù)可從幾次到10萬(wàn)次。為此，選購(gòu)時(shí)按好評(píng)優(yōu)先及購(gòu)買(mǎi)次數(shù)優(yōu)先的原則進(jìn)行選購(gòu)，價(jià)格在18~26元/g；同時(shí)記錄好評(píng)數(shù)、價(jià)格及購(gòu)買(mǎi)次數(shù)。所有花粉樣品在試驗(yàn)期間存放于4℃冰箱保存。
1.2 花粉數(shù)量檢驗(yàn)及TTC染色法活力測(cè)定
取10mg花粉樣品置于1mL蒸餾水中，混合均勻。隨后取1μL混合液置于顯微鏡下觀察花粉細(xì)胞數(shù)目及活力檢驗(yàn)。1μL花粉懸浮液相當(dāng)于10μg的購(gòu)買(mǎi)花粉(其中包括輔料)?；ǚ刍盍Σ捎肨TC染色法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)參照張鴻等的方法。為進(jìn)一步優(yōu)化活力測(cè)定，采用正交和響應(yīng)面進(jìn)行設(shè)計(jì)。在正交設(shè)計(jì)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)中采用3因子3水平設(shè)計(jì)，因子包括 TTC濃度(A,0.3%、0.5%、0.7%)、染色溫度(B,20、25、30℃)、染色時(shí)間(C,20、25、30min)。

▲恒溫震蕩氣育培養(yǎng)箱檢測(cè)獼猴桃花粉活性

1.3 離體萌發(fā)培養(yǎng)液的優(yōu)化
在蒸餾水中分別配制蔗糖溶液為5%、10%、15%、20%和硼酸溶液為0.1%、0.15%、0.2%的組合萌發(fā)液。將稀釋不同倍數(shù)的花粉置于花粉萌發(fā)液中，隨后在溫度為(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在顯微鏡下觀察，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑作為花粉萌發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 授粉試驗(yàn)
采用臣風(fēng)果樹(shù)電動(dòng)授粉機(jī)進(jìn)行授粉。選擇天氣晴朗的8:00-10:00進(jìn)行授粉。授粉在云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司的獼猴桃栽培基地進(jìn)行，按說(shuō)明書(shū)將混有輔料的獼猴桃花粉加入授粉器，以點(diǎn)授法對(duì)雌花花柱授粉，做好標(biāo)記，授粉只進(jìn)行1次，后期以坐果數(shù)統(tǒng)計(jì)坐果率，坐果率= 坐果數(shù)/授粉花朵數(shù)x100%

1.5 數(shù)據(jù)處理
運(yùn)用Excel、SPSS 26.0和Design Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)、差異顯著性檢驗(yàn)，對(duì)花粉活力進(jìn)行分析。

▲獼猴桃花粉活力測(cè)定條件的優(yōu)化研究

2 結(jié)果與分析
2.1 TTC染色花粉活力的正交試驗(yàn)結(jié)果
從5份花粉中選取2份由云南建水良豐農(nóng)業(yè)生物技術(shù)公司所提供的獼猴桃花粉，對(duì)其進(jìn)行花粉數(shù)量、萌發(fā)率、花粉活力進(jìn)行測(cè)定，花粉活力的測(cè)定條件為T(mén)TC濃度0.7%、染色溫度25℃、染色時(shí)間30min。表1的結(jié)果表明，2批獼猴桃花粉在花粉數(shù)量、萌發(fā)率及花粉活力均存在顯著性差異。為優(yōu)化花粉活力的檢驗(yàn)條件，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)(表2)。表2顯示TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間分別為0.7%、30℃、30min(處理7)的花粉活力最高(97%)，而TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間分別為0.3%、20℃、20min(處理1)的花粉活力最低(22%)。

▲獼猴桃花粉活力測(cè)定條件的優(yōu)化研究

方差分析(表3)顯示，TTC濃度、染色溫度、染色時(shí)間的P值分別為0.021、0.033、0.026，所有P值均小于0.05，表明這些因素對(duì)TTC檢驗(yàn)花粉活力均有顯著性影響。在15%蔗糖、0.15%硼酸、培養(yǎng)時(shí)間24h下進(jìn)行花粉萌發(fā)檢驗(yàn)(圖1)，結(jié)果顯示2批花粉的萌發(fā)率也存在差異，在5、10、24h的萌發(fā)率均存在顯著性差異，且花粉數(shù)量多的樣品萌發(fā)率并不高。

2.2 TTC 染色花粉活力響應(yīng)面優(yōu)化
為進(jìn)一步優(yōu)化TTC染色花粉活力檢驗(yàn)的條件，基于Design Expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表5)，模型F=5.75，且P≤0.05，表明模型差異顯著。校正決定系數(shù)R2=0.7278，相關(guān)系數(shù)R2=0.8809，表明該模型的擬合度較好，可用于花粉生活力的檢驗(yàn)。模型的變異系數(shù)為9.6%(<10%)，表明模型穩(wěn)定性良好，試驗(yàn)操作可靠。模型的信噪比為7.834(>4)，表明該模型能真實(shí)地反映試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)面法測(cè)定獼猴桃花粉生活力TTC法測(cè)定的最佳條件為T(mén)TC濃度0.7%、染色溫度30℃、染色時(shí)間25min，結(jié)果與正交試驗(yàn)一致。經(jīng)回歸分析得回歸方程，如式(2)。

花粉活力=73.00+10.13A-0.37B+3.00C+7.75AB-4.50AC+1.00BC+6.12A2-8.38B2-10.63C……..(2)式中，A、B、C分別為T(mén)TC濃度、染色時(shí)間、染色溫度。
依回歸模型分析，經(jīng)Design-Expert V8.0.6.1軟件對(duì)TTC濃度、染色時(shí)間及染色溫度3個(gè)因素進(jìn)行分析，得到對(duì)應(yīng)的等高線圖及響應(yīng)曲面圖(圖2)。

在DesignExpert軟件分析中，等高線的形態(tài)可直觀反映出因素間交互作用的大小，圓形表示交互作用小，橢圓形則相反叫，而響應(yīng)面的坡度變化則可反映出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響力，坡度越緩表明影響越小。從圖2可看出，TTC濃度、染色時(shí)間及染色溫度三者間的互作較為復(fù)雜，染色溫度與TTC濃度的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響最大，響應(yīng)面的傾斜度最高，其次是染色時(shí)間與 TTC濃度，最后是染色溫度與染色時(shí)間。

2.3 花粉離體萌發(fā)、授粉及其與活性的相關(guān)性
為驗(yàn)證花粉活力與花粉離體萌發(fā)、授粉間相關(guān)性，選擇蔗糖、硼酸溶液對(duì)獼猴桃花粉進(jìn)行離體萌發(fā)，蔗糖濃度設(shè)定為5%、10%、15%、20%，硼酸濃度為0.1%、0.15%、0.2%，花粉選擇活力較高的B公司。結(jié)果見(jiàn)圖3。蔗糖濃度和硼酸濃度分別為15%、20%，0.15%、0.2%時(shí)，獼猴桃的花粉萌發(fā)較高，其中15%蔗糖條件下萌發(fā)率最高，但在硼酸濃度分別為15%、20%條件下，其萌發(fā)率并無(wú)顯著性差異。因此，可將15%蔗糖、15%硼酸作為獼猴桃花粉的最佳萌發(fā)條件。

表6顯示，5批花粉雖在花粉數(shù)量上差異不顯著，但花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均表現(xiàn)出顯著性差異。尤其是坐果率的差異會(huì)嚴(yán)重影響到獼猴桃的產(chǎn)量。對(duì)花粉活力、萌發(fā)率和坐果率之間相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算，得出花粉活力和萌發(fā)率相關(guān)系數(shù)為0.667，萌發(fā)率和坐果率相關(guān)系數(shù)為0.928，花粉活力和坐果率相關(guān)系數(shù)為0.843。

因此，坐果率在很大程度上取決于萌發(fā)率(表7)。研究表明,利用獼猴桃花粉萌發(fā)率顯示其花粉活力更為合理，萌發(fā)率的測(cè)定雖不復(fù)雜，但測(cè)定時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)。同時(shí)，將前期電商平臺(tái)采購(gòu)時(shí)的好評(píng)、拼購(gòu)次數(shù)及價(jià)格進(jìn)行排位(表6)，發(fā)現(xiàn)已拼次數(shù)多、好評(píng)排位靠前的花粉，其萌發(fā)率、坐果率也較高。因此，在電商平臺(tái)選購(gòu)獼猴桃花粉可首先考慮購(gòu)買(mǎi)次數(shù)多、好評(píng)優(yōu)先的產(chǎn)物，其次才考慮價(jià)格。

▲packaging kiwi pollen

3 結(jié)論與討論
TTC染色是檢測(cè)種子活力、花粉活力的常用技術(shù)，其原理在于TTC可與活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶產(chǎn)生紅色，從而以色澤判斷細(xì)胞的活力。有研究表明溫度對(duì)植物花粉的萌發(fā)具有重要的影響，因此以此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。張鴻等采用TTC法和I2-IK法測(cè)定花粉活力，認(rèn)為T(mén)TC和I2-IK不適用于獼猴桃花粉活力的測(cè)定，并認(rèn)為其原因在于獼猴桃花粉內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和淀粉含量較低，不能被染成相應(yīng)的顏色。本試驗(yàn)的5個(gè)樣品中，采用TTC測(cè)定法所測(cè)定的花粉活力在(45±6)%~(90.1±9)%，所有樣品都能染色，與張鴻等的結(jié)論不一致，因此TTC是否可用于獼猴桃花粉活力的檢驗(yàn)也許與品種差異有關(guān)。劉成琴等報(bào)道TTC對(duì)部分植物的花粉染色效果差的原因是花粉壁太厚，染色液無(wú)法滲透，而非脫氫酶活性太低。下一步將對(duì)不同獼猴桃品種的花粉進(jìn)行琥珀酸脫氫酶測(cè)定，或通過(guò)測(cè)定不同獼猴桃品種花粉璧的厚度及其對(duì)染料的透性進(jìn)行補(bǔ)充。本試驗(yàn)中，萌發(fā)率與坐果率的相關(guān)性較高(0.928)，與張鴻等的結(jié)果相吻合。從本試驗(yàn)所測(cè)的5份購(gòu)于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)的獼猴桃花粉數(shù)據(jù)來(lái)看，雖購(gòu)于不同平臺(tái)的獼猴桃花粉，花粉數(shù)量上差異不大，但在花粉活力、萌發(fā)率、坐果率均存在較大差異。干燥方法、貯藏溫度、花粉來(lái)源、脫藥時(shí)間都會(huì)影響獼猴桃花粉活力。因此，在互聯(lián)網(wǎng)背景下，涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)加強(qiáng)管理，建議相關(guān)部分制定法規(guī)保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者的利益。

▲Pollen Collection獼猴桃花采集

花粉離體培養(yǎng)萌發(fā)法是檢驗(yàn)花粉生活力最直接、有效的方法，離體萌發(fā)培養(yǎng)基配制主要由蔗糖、硼等營(yíng)養(yǎng)成分組成。蔗糖普遍存在于植物體中，不同植物花粉萌發(fā)的最佳糖濃度差異大陽(yáng)。蔗糖能夠促進(jìn)植物花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)，并在外部環(huán)境中保持滲透壓的平衡和穩(wěn)定。在本研究中，15%蔗糖是花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)的最適濃度，這與張鴻等的研究結(jié)果有差異。一方面可能與品種相關(guān)，另一方面與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的梯度有關(guān)，在張鴻等的試驗(yàn)中，其蔗糖濃度從10%直接升到了20%，無(wú)15%濃度的設(shè)置。硼是影響植物花粉萌發(fā)率高低的重要因素，硼離子能和蔗糖形成絡(luò)合物，增強(qiáng)糖分的吸收與代謝，極大地促進(jìn)植物花粉萌發(fā)，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，低濃度的硼酸可能會(huì)影響花粉萌發(fā)的生長(zhǎng)，但硼酸濃度過(guò)高也可能產(chǎn)生較高的滲透壓，從而影響花粉萌發(fā)的生長(zhǎng)。

▲Kiwi pollen is tested before sales

本試驗(yàn)中硼的最佳濃度為0.15%，在張鴻等的試驗(yàn)中，硼的最佳濃度為0.1%，其硼設(shè)置的也是從0.1%直接升到了0.2%，無(wú)0.15%濃度的設(shè)置。張偉等3在三角梅花粉萌中發(fā)現(xiàn)，不添加蔗糖或硼酸時(shí)，花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)極少，添加適宜硼酸和蔗糖可顯著提高花粉萌發(fā)和花粉管伸長(zhǎng)，表明萌發(fā)需要蔗糖和硼酸共同作用。對(duì)斐濟(jì)果的研究表明Ca+濃度是影響花粉萌發(fā)的次要因素和花粉管生長(zhǎng)的主要因素。Ca+對(duì)獼猴桃花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的影響需做進(jìn)一步研究。從本試驗(yàn)看，萌發(fā)率均小于坐果率，其原因是否與授粉量相關(guān)也需要進(jìn)一步研究。

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