摘 要：為了明確近期新西蘭報道的侵染獼猴桃的新病毒——獼猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）在四川地區(qū)獼猴桃上的發(fā)生情況及其分子特性，采用 RT-PCR 對來自四川 6 個地區(qū)疑似感染病毒的 90 份獼猴桃主栽品種‘紅陽’和‘金果’的葉片樣品進行檢測。結(jié)果表明，22 份樣品為 AcV-1 陽性，檢出率為 24.4%。將獲得的 5 個 AcV-1 分離物和已報道的新西蘭分離物 K75 的外殼蛋白（coat protein，CP）基因序列進行比對，結(jié)果表明，分離物間核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分別為 84.8% ~ 97.1%和 89.7% ~99.6%，其中除邛崍分離物 HYH5 與新西蘭分離物 K75 的核苷酸序列相似性較高（97.1%）外，其余 4 個分離物均低于 91%。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，這些分離物主要聚集在 3 個分支上，分離物 HYH5 與新西蘭分離物 K75 位于同一分支，其余分離物位于另外 2 個分支。
關(guān)鍵詞：獼猴桃；獼猴桃病毒 1；RT-PCR；CP 基因；分子特征
▲Golden Kiwi
四川省是中國獼猴桃優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一，其栽培面積和產(chǎn)量均位居全國前列。目前獼猴桃已成為四川省的優(yōu)勢特色林果類產(chǎn)業(yè)（劉強和李曉，2014）。果樹病毒病是一種潛伏期長、隱患大的病害，可造成樹勢衰退、抗病性減弱、果實產(chǎn)量及品質(zhì)下降等（郝璐 等，2015；任芳 等，2018）。新西蘭較早地開展了獼猴桃病毒病的研究工作，其檢疫部門在1983年記錄了獼猴桃受病毒感染的跡象（Blouin et al.，2013）；隨后 Clover 等（2003）從一批處于檢疫隔離期的獼猴桃中首次檢測到蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV），該病毒在中國和印度的獼猴桃中也均有報道（Bhardwaj et al.，2014；Wang et al.，2017）；Chavan 等（2013）從中華獼猴桃上首次檢測到柑橘葉斑駁病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）；近期 Blouin 等（2018）采用高通量測序技術(shù)鑒定出一種侵染獼猴桃的新病毒，并命名為獼猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1），癥狀表現(xiàn)為葉片褪綠、黃化，有壞死環(huán)斑（Blouin et al.，2018；Peng et al.，2019）。Veerakone 等（2018）在中華獼猴桃中鑒定出一種新的獼猴桃病毒，命名為獼猴桃種傳潛伏病毒（Actinidia seed-borne latent virus，ASbLV）。
▲yellow Kiwifruit
目前國內(nèi)外大約有 17 種侵染獼猴桃的病毒被報道（王然 等，2017；Wang et al.，2017； Veerakone et al.，2018）。在中國已鑒定出 8 種能感染獼猴桃的病毒：獼猴桃病毒 A（Actinidia virus A，AcVA）和獼猴桃病毒 B（Actinidia virus B，AcVB）（鄭亞洲 等，2015）、柑橘葉斑駁病毒（Citrus leaf blotch virus，CLBV）（朱晨熹 等，2016）、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）（Wang et al.，2017）、獼猴桃褪綠環(huán)斑相關(guān)病毒（Actinidia chlorotic ringspots-associated virus，AcCRaV）（Zheng et al.，2017）、番茄壞死斑點相關(guān)病毒（Tomato necrotic spot associated virus，TNSaV）和黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）（Wang et al.，2016；2018），以及獼猴桃病毒 1（Actinidia virus 1，AcV-1）（Peng et al.，2019；Wen et al.，2019）。
AcV-1 為長線形病毒科（Closteroviridae）的新成員，基因組為 18 848 nt 的正單鏈 RNA（+ssRNA），含 12 個開放閱讀框（Open reading frame，ORF），主要編碼 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、外殼蛋白（Coat protein，CP）和熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）等（Blouin et al.，2018）。目前在湖北和四川均有 AcV-1 侵染獼猴桃的報道（Wen et al.，2019）。為明確四川地區(qū)獼猴桃病毒的發(fā)生狀況及其分子特性，自 2016 年起開展四川地區(qū)獼猴桃病毒病的調(diào)查與鑒定工作。在田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，采集的獼猴桃癥狀與已報道的 AcV-1 引起的癥狀類似。采用 RT-PCR 檢測技術(shù)，對 AcV-1 獼猴桃分離物的分子變異情況進行分析，以期為該病毒的早期診斷及其分子特征研究奠定基礎(chǔ)。
▲Health Benefits of Kiwi Fruit
1 材料與方法
1.1 試驗材料
2017 年和 2018 年 5—8 月分別從四川省彭州、邛崍、都江堰、蒲江、德陽、廣元等地采集‘紅陽’‘金果’獼猴桃（Actinidia spp.）疑似感病的葉片樣品 90 份（表 1），主要表現(xiàn)出褪綠斑點和黃化兩種癥狀（圖 1）。
1.2 引物設(shè)計與合成
根據(jù)新西蘭所報道的 AcV-1 外殼蛋白基因序列（登錄號：KX857665）設(shè)計擴增引物AcV-1-CP-1F/1R：5′-ATGACTACCAAAGAAACGAA3′/5′-TCAATGATAACCTGAAGT GA-3′，預(yù)期擴增片段大小為 732 bp。根據(jù) NCBI 所記載的獼猴桃肌動蛋白基因（Actin 1，ACT1）序列（登錄號：EF063572 ）， 利 用 Premier Premier 5.0 設(shè)計擴增內(nèi)參引物 ACT1F/R ： 5′-AATGGTGAAG GCTGGGTTTG-3′/5′-TGAGTGGTGCCTCTGTAAGC-3′，預(yù)期擴增片段大小為 287 bp。所用引物均由成都擎科生物技術(shù)有限公司合成。
（東紅獼猴桃）
1.3 總 RNA 提取
取獼猴桃病葉 0.1 g 加液氮于研缽中研磨，將粉末轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管，迅速加入 1 mL 于 65 ℃中預(yù)熱 20 min 的 CTAB RNA 提取緩沖液（2% CTAB，2% PVP k30，100 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 8.0，1.4 mol · L-1 NaCl，20 mmol · L-1 EDTA，pH 8.0 0.5% β–硫基乙醇），渦旋振蕩混勻，65 ℃水浴加熱20 min，4 ℃ 12 000 r ? min-1 離心 5 min。上清液經(jīng)酚︰氯仿︰異戊醇（25︰24︰1）抽提 2 次，4 ℃下12 000 r ? min-1 離心 10 min，再加入等體積的 4 mol · L-1 氯化鋰，–20 ℃沉淀 4 h。沉淀經(jīng) 75%乙醇洗滌 1 次，4 ℃ 12 000 r ? min-1 離心 5 min，無水乙醇洗滌 1 次，4 ℃ 12 000 r ? min-1 離心 5 min，自然干燥，加入 30 μL DEPC 處理水混勻，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
▲正在采摘獼猴桃雄花
1.4 RT-PCR
以提取的總 RNA 為模板逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，反應(yīng)體系為 20 μL。在滅菌的 1.5 mL 離心管中依次加入 dNTPs（2.5 mmol · L-1）4.0 μL，隨機引物（10 mmol · L-1）1 μL，RNA 模板 5 μL，DEPC 處理水 4 μL；瞬時離心混勻置于 65 ℃水浴 8 min，冰上靜置 2 min。再加入 5 ×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 4 μL，RNA 酶抑制劑（RNasin，40 U · mL-1）0.5 μL，M-MLV（200 U · mL-1）0.5 μL，DTT 1.0 μL，37 ℃恒溫水浴 1 h；70 ℃水浴 15 min 終止反應(yīng)，并將產(chǎn)物存于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?br />
PCR 反應(yīng)總體系為 25 μL：含 2 × Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol · μL-1）各 1 μL，cDNA 2 μL 和 ddH2O 8.5 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，循環(huán) 34 次；72 ℃延伸 5 min。
（紅心獼猴桃苗木）
1.5 擴增產(chǎn)物克隆及序列分析
PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，按微量瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒說明書（上海生工）對 PCR 產(chǎn)物進行回收。回收產(chǎn)物連接至 pMD19-T Vector（大連 TaKaRa 公司）后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落，搖菌培養(yǎng)，隨機選取 1 ~ 3 個經(jīng) PCR 鑒定的陽性克隆，送至成都擎科生物技術(shù)公司進行測序驗證。采用生物學(xué)軟件 DNAMAN version 9 和 DNASTAR 完成序列比對；采用MEGA 6.0 軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 重復(fù)次數(shù)為 1 000。
2 結(jié)果與分析
2.1 總 RNA 及 RT-PCR 引物擴增質(zhì)量檢測
以 cDNA 為模板對內(nèi)參基因進行普通 RT-PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（圖 2，A）顯示，獼猴桃內(nèi)參基因 ACT1 與預(yù)期大小的目的條帶一致，且條帶單一，無非特異擴增，表明反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可用于后續(xù)的病毒檢測。以 cDNA 及 AcV-1 陽性質(zhì)粒為模板對 AcV-1 的 CP 基因進行 RT-PCR 擴增（圖 2，B）：在健康植株和空白對照中均無擴增條帶產(chǎn)生，病樣植株中擴增出的條帶與 AcV-1 的陽性質(zhì)粒大小一致，說明 AcV-1 CP 引物擴增特異性較好。
▲Kiwi Orchard Work
2.2 AcV-1 在四川獼猴桃主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生情況
利用 RT-PCR 檢測 90 份疑似病毒侵染的樣品，22 份樣品的檢測結(jié)果為 AcV-1 陽性，總檢出率為 24.4%（表 1）。其中，葉片為黃化癥狀的樣品有 14 份，集中在都江堰、邛崍地區(qū)；褪綠斑點癥狀的樣品有 3 份，主要分布在彭州和蒲江地區(qū)；有 5 份陽性樣品，葉片無明顯癥狀。在彭州地區(qū)的‘紅陽’和‘金果’品種各有 1 株檢測到 AcV-1，檢出率為 12.5%。在都江堰和邛崍地區(qū)‘紅陽’品種中 AcV-1 的陽性檢出數(shù)量分別為 4 株和 6 株；‘金果’品種中 AcV-1 的陽性檢出數(shù)量分別為 3株和 4 株，這表明同一地區(qū)不同品種獼猴桃中均存在 AcV-1 的侵染。都江堰和邛崍兩地區(qū)的樣品中AcV-1 檢出率較高，分別為 28.0%和 33.3%。另外，在德陽、廣元、蒲江的獼猴桃樣品中 AcV-1 檢出較少，僅各有 1 株樣品檢測到 AcV-1。
▲夏天的獼猴桃果園
2.3 AcV-1 分離物 CP 基因核苷酸和編碼氨基酸序列分析
將 22 個陽性樣品的擴增產(chǎn)物進行克隆測序，序列比對結(jié)果顯示：都江堰、蒲江的 8 個陽性樣品擴增產(chǎn)物的序列完全相同，占陽性樣品的 36.4%；彭州地區(qū)的 2 個擴增產(chǎn)物序列完全一致，占 9.1%；德陽和廣元的 2 個陽性擴增產(chǎn)物序列相同，占 9.1%；邛崍的 10 個陽性樣品序列主要分為兩類，分別占 9.1%（2 個）和 36.4%（8 個）。
▲獼猴桃雄花展示
從這些分離物中選擇 5 個有代表性的克隆——蒲江分離物 PJ1（登錄號 MH557854）、彭州分離物 WB13（MK421388）、邛崍分離物 HYH5（MK421390）和 HYH8（MK421389）、廣元分離物 GYH1（MH557856）進行 AcV-1 外殼蛋白基因序列分析。結(jié)果（表 2）顯示，5 個 AcV-1 分離物間核苷酸和氨基酸序列一致性分別為 84.8% ~ 92.9%和 89.7% ~ 96.7%，其中邛崍地區(qū)的 HYH5 和 HYH8 兩個分離物間核苷酸和氨基酸序列存在較大的分子差異，其一致性分別為 87.7%和 91.0%。四川地區(qū) AcV-1的5 個分離物與新西蘭報道的分離物K75 核苷酸和氨基酸序列一致性分別為87.3% ~ 97.1%和91.4% ~ 99.6%。分離物 HYH5 與新西蘭分離物 K75 的核苷酸和氨基酸序列一致性最高，分別為 97.1%和99.6%，分離物 HYH8 與新西蘭分離物 K75 的核苷酸和氨基酸序列一致性最低，分別為 87.3%和91.4%。
利用 MEGA6.0 對 5 個分離物和新西蘭分離物 K75 的核苷酸和氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果（圖3，A、B）顯示，分離物 HYH5 與新西蘭分離物 K75 聚集在同一進化分支上，其他分離物序列與新西蘭分離物 K75 存在一定的遺傳距離，分別聚集成 2 個進化分支。以上結(jié)果表明，四川地區(qū) AcV-1分離物可分為 3 個進化分支，新西蘭的分離物 K75 與分離物 HYH5 親緣關(guān)系最近，四川地區(qū)的 AcV-1分離物間具有遺傳變異現(xiàn)象。
▲獼猴桃果園幼果
3 討論
本研究中基于 AcV-1 外殼蛋白基因序列設(shè)計特異性引物，對來自四川 6 個不同地區(qū)的獼猴樣品進行病毒檢測，首次報道了 AcV-1 在四川地區(qū)的發(fā)生情況。在 5 個采樣地中，病毒檢出率為 12.5% ~ 33.3%，邛崍所采集到的樣品中檢出率最高，廣元地區(qū)因樣品數(shù)太少未計算。90 份獼猴桃樣品中，22 份樣品為 AcV-1 陽性，總檢出率為 24.4%。本研究中 14 份檢出 AcV-1 的樣品葉片中表現(xiàn)黃化，3份表現(xiàn)褪綠斑點，這與已報道（Blouin et al.，2018；Peng et al.，2019）的該病毒所引起的癥狀基本一致；但部分帶病毒樣品葉片無明顯癥狀，這可能是由于該樣品為病毒感染初期，還未出現(xiàn)明顯癥狀。
對不同分離物 CP 基因核苷酸和氨基酸序列一致性進行分析，發(fā)現(xiàn)分離物間的核苷酸和氨基酸最大序列差異分別為 12.3%和 9.9%，同時本研究中發(fā)現(xiàn)邛崍分離物 HYH5 與新西蘭分離物 K75 的CP 基因核苷酸序列一致性最高，為 97.1%，但與同一地區(qū)分離物 HYH8 的序列一致性僅為 87.7%。
通過分離物 CP 基因系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，各分離物主要聚集在 3 個進化分支上，分離物 HYH5與新西蘭分離物 K75 位于同一進化分支中。以上結(jié)果表明該病毒具有一定的分子差異，存在遺傳分化現(xiàn)象。
▲新西蘭的獼猴桃雄花園Kiwi Male Garden in New Zealand
Abstract：Recently，a new virus that infected kiwifruit，Actinidia virus 1（AcV-1），has been reported in New Zealand. In order to determine the occurrence and molecular characterization of AcV-1 in kiwifruit cultivars（‘Hongyang’and‘Jinguo’）in Sichuan Province，90 kiwifruit leaves samples of suspected viral infection were tested for AcV-1 by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The results showed that 22 samples were positive to AcV-1，and the infection rate was 24.4%. The coat protein gene （CP）sequences of the obtained five AcV-1 isolates were compared with isolate K75 which was reported in New Zealand. Results showed that the sequences identities of CP nucleotides and amino acid among these isolates were 84.8%–97.1% and 89.7%–99.6%，respectively. Among them，the sequence identities
of CP nucleotides were less than 91% between New Zealand isolate K75 and four of these isolates except Qionglai isolate HYH5，which was 97.1%. Phylogenetic analysis based on CP gene of each isolate showedthat these isolates were mainly clustered into three branches，HYH5 and New Zealand isolate K75 were located in the same branch，and the other isolates were located in the other two branches.
Keywords：kiwifruit；Actinidia virus 1；RT-PCR；CP gene；molecular characterization
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